“工欲善其事，必先利其器”，分析表征技術和設備在現(xiàn)代科學研究中的作用及地位越來越重要。比如在生命科學研究領域，很重要的一個過程是對生
物大分子(如蛋白質(zhì))結構進行解析。最開始科學家使用X射線晶體學成像技術來解析蛋白質(zhì)結構，但是鑒于蛋白質(zhì)的松散構型，難以規(guī)律集群進行成晶。使用這種方法時，科學家們需要先對樣品進行結晶——打包成穩(wěn)定的、有序晶體，然后再允許X射線穿過樣品進而成像
。這就造成了結構解析工作復雜程度大大增加，有時候解析一種蛋白質(zhì)需要一個團隊花費幾個月甚至幾年的時間才能完成。
【何為冷凍電鏡？】
為了提高研究效率和精準度，科學家在電子顯微鏡的基礎上于上世紀70年代開發(fā)出了可以直接“觀察”蛋白質(zhì)
結構的冷凍電鏡(Cryo-EM)。相比于X射線技術，電子顯微鏡將經(jīng)加速和聚集的電子束轟擊到薄樣上，使用感學器件來對散射后的電子成像，而因為電子的德布羅意波長非常短，使得這種顯微技術的分辨率在理論上可以高達0.1 nm，因而這種可以用來觀測物質(zhì)精細結構。
而相對于傳統(tǒng)電鏡，冷凍電鏡的制樣環(huán)境是液氮浴中的液態(tài)乙烷罐中，這樣樣品會急速冷卻以至于冰晶都來不及形成，而是形成一種叫做玻璃態(tài)晶的物質(zhì)，因而可以很好地保持生物大分子地結構完整性。
冷凍電鏡樣品結構示意圖
當電子束打到分子上之后就會在膠片上留下不同的印記，盡管這些
印記是二維圖像，但是卻包含了分子的三維信息。在隨后的研究中，科學家們對這些圖像進行平均化建模，而后產(chǎn)生了蛋白質(zhì)的三維模型。
由于冷凍電鏡的出現(xiàn)大大加快了生命科學以及臨床醫(yī)學等領域的發(fā)展，因此對冷凍電鏡發(fā)明或改進具有里程碑意義的德裔生物物理學家Joachim
Frank、蘇格蘭分子生物學家和生物物理學家Richard Henderson和瑞士洛桑大學生物物理學榮譽教授Jacques Dubochet三人共同獲得的了2017年諾貝爾化學獎(for developing cryo-electron microscopy for the high-resolution structure determination of
biomolecules in solution)。
【原子級分辨率新冷凍電鏡】
盡管電子顯微鏡的理論分辨率可以達到1?，但是目前冷凍電鏡的分辨率為1.54~4?，雖然這個分辨率已經(jīng)
可以借助三維建模軟件來建立蛋白質(zhì)的原子模型(＜4?)，但是還不能實現(xiàn)對真實原子位置直接可視化觀測(對分辨率的要求為＜1.5?)。2020年5月22日，在bioRxiv預印版服務器上刊登了兩篇關于冷凍電鏡的最新研究進展的論文，研究內(nèi)容均是對現(xiàn)有的冷凍電鏡進行硬件(
電子源、能量過濾和相機)和軟件優(yōu)化，首次利用冷凍電鏡看到蛋白質(zhì)中的單個原子和化學鍵變化。這打破了冷凍電鏡的觀測壁壘，對于其實現(xiàn)原子級分辨率具有里程碑作用。
第一項研究由德國哥廷根馬克斯·普朗克生物物理化學研究所的生物化學家和電子顯微鏡專家Holger Stark教授領導的團隊完成，該研究以題為“Breaking the next Cryo-EM resolution barrier – Atomic resolution determination of proteins!”的論文
發(fā)表在bioRxiv上。在這項研究工作中，Holger Stark教授團隊使用了一個帶有附加電子光學元件(減少電子束的能量傳播和通過像差校正器減少像差來改善了光學特性)的原型儀器來提高電鏡的分辨性能，并對脫鐵鐵蛋白的原子結構進行了觀察和建立。實驗結果顯示改進
后的冷凍電鏡對脫鐵鐵蛋白的結構分辨率為1.25?，并且第一次可以看到蛋白質(zhì)中的單個原子、氫原子的密度和單原子化學修飾。同時，利用該冷凍電鏡得到的脫鐵鐵蛋白結構的3D信息含量幾乎是目前世界記錄(1.54?)的兩倍。
真正的原子分辨率:1.25 ?的分辨率顯示單個原子和氫原子
第二項研究由英國劍橋分子生物學醫(yī)學研究委員會實驗室(MRC-LMB)的結構生物學家A. Radu Aricescu和Sjors H.W. Scheres教授領導的研究團隊完成，該研究以“Single-particle cryo-EM
at atomic resolution”的論文發(fā)表在bioRxiv上。在這項研究中，研究團隊使用新的電子源、能量過濾器和相機對冷凍電鏡進行改進，實現(xiàn)了人類膜蛋白(β3 GABAA受體)1.7?的分辨率, 同時實現(xiàn)了老鼠脫鐵鐵蛋白1.2?的分辨率，這一結果與Holger Stark教授團隊研究
成果基本一致。這項研究提供了一個蛋白質(zhì)分子的原子分辨率單粒子冷凍電鏡。研究中得到的原子級精細圖譜可以詳細地理解小分子的配位，可視化溶劑分子和多種氨基酸的替代構象，以及明確地構建有序的酸性側鏈和聚糖。此外，許多氫原子的散射勢可以在不同的圖
中顯示出來，從而可以直接分析氫鍵網(wǎng)絡。
原子分辨率冷凍電鏡
重建的β3 GABAA受體結構
冷凍電鏡進軍能源領域
冷凍電鏡最早是為方便生物大分子結構解析而研制出來的，它的主要優(yōu)勢在于在觀察時可以保持物質(zhì)在溶液狀態(tài)中的形態(tài)結構完整性。因此，近年來許多科研人員借助冷凍電鏡來研究無生物活性材料的結構
和演變。比如斯坦福大學崔屹教授聯(lián)合諾貝爾物理學獎得主朱棣文教授在2017年利用冷凍電鏡對鋰金屬枝晶進行了原子級別的觀測，該研究成果發(fā)表在Science[Li et al., Science 358, 506–510 (2017)]上。
2015年，美國布魯克海文國家實驗室Oleg Gang教授研究團隊利用冷凍電鏡研究了DNA和Au顆粒自組裝得到的八面體3D中尺度團簇。利用重構
技術將這種自組裝結構清楚的展示出來，從而深入的研究了其自組裝機理，對于精確控制3D中尺度自組裝材料提供了基礎。
冷凍電鏡研究自組裝
[Nature Nanotechnology, 2015, 10(7):637-644]
冷凍電鏡進軍高分子
2020年3月30日，日本信洲大學Daisuke Suzuki教授課題組采用低溫電子層析成像技術（cryo-ET），首次得到了納米復合微凝膠的詳細結構信息。cryo-ET表明：在微凝膠內(nèi)部形成的
SDS聚集體充當了聚苯乙烯的成核點位，阻止了PS顆粒的融合，解決了長久以來學術界對該問題的爭論。
【總結與展望】
原子位置的直接顯示對于理解蛋白質(zhì)催化的化學反應機制以及研究藥物結合和對蛋白質(zhì)功能的干擾至關重要。劍橋大學和馬克斯·普朗克
所研究小組經(jīng)過對現(xiàn)有冷凍電鏡的改造，首次觀察到了蛋白質(zhì)中的單個原子，這打破了現(xiàn)有冷凍電鏡的觀測壁壘，為蛋白質(zhì)結構的解析工作以及其它物質(zhì)結構的確定提供了更精準的分析手段。
參考文獻：
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