微條形碼技術(shù)是一種通用技術(shù),可為生物、醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)領(lǐng)域的微米和納米級應(yīng)用程序提供多重和高通量信息存儲。但是,當(dāng)前的熒光條形碼技術(shù)主要使用光譜多路復(fù)用和熒光強度(FI)編碼,它們通常容易受到編碼元素的光譜重疊的影響。此外,由于樣品濃度和外部微環(huán)境的可變性,很難獲得定量的讀數(shù)。利用熒光壽命(fluorescence lifetime),在微條形碼區(qū)域能提供可重現(xiàn)輸出。借助最新的顯微成像技術(shù),熒光壽命可以用作一種簡單的技術(shù),最大程度地降低傳統(tǒng)熒光條形碼的局限性,隨著時間的推移提供可重復(fù)且定量的讀數(shù)。但是,尋找能夠靈活調(diào)節(jié)熒光壽命的響應(yīng)材料仍然是一項持續(xù)的挑戰(zhàn)。

研究成果

基于以上問題,來自英國伯明翰大學(xué)化學(xué)學(xué)院的Rachel K. O’Reilly教授課題組設(shè)計了一種由兩種成分組成的光可切換(photo-switchable)納米凝膠,該凝膠在通過光輻照引起的光致異構(gòu)化誘導(dǎo)的能量轉(zhuǎn)移過程中表現(xiàn)出可變的熒光壽命。可以使用熒光壽命成像顯微鏡(FLIM)直觀地繪制這種遠程操縱的熒光壽命特性,從而可以在微尺度上選擇性地存儲和顯示信息。并且,在細胞器成像中,可將活細胞和亞細胞細胞器的熒光壽命成像中的背景影響降至最低。相關(guān)成果以“Manipulating the fluorescence lifetime at the sub-cellular scale via photo-switchable barcoding”為題,發(fā)表在《Nature communciation》上。

《Nature》子刊: 光開關(guān)納米凝膠, 在微尺度上選擇性地存儲和顯示信息

圖文解析

1. 光開關(guān)納米凝膠的設(shè)計與制備

《Nature》子刊: 光開關(guān)納米凝膠, 在微尺度上選擇性地存儲和顯示信息
圖1光開關(guān)聚合物納米凝膠的制備

 

作為一種非破壞性性刺激,光是用于無需外部接觸即可進行外部操縱的重要工具之一,因此非常適合信息標(biāo)記、實時標(biāo)記和選擇性跟蹤。在這項研究中,研究者設(shè)計了一種基于光的可切換壽命條形碼系統(tǒng),該系統(tǒng)基于包含取代的馬來酰亞胺(DTM)和螺吡喃(SP)開關(guān)的兩組分納米凝膠。通過誘導(dǎo)可逆的光異構(gòu)化過程,可以通過DTM熒光基團與SP光致變色劑的開環(huán)形式之間的F?rster共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)實現(xiàn)具有相似結(jié)構(gòu)但具有多重壽命的納米凝膠,從而實現(xiàn)了可控的、非可控的動態(tài)熒光壽命編碼。

2. 評估光異構(gòu)化過程中的能量轉(zhuǎn)移和光物理行為

《Nature》子刊: 光開關(guān)納米凝膠, 在微尺度上選擇性地存儲和顯示信息
圖2 能量轉(zhuǎn)移涉及納米凝膠的光物理行為

 

DTM在交聯(lián)的聚合物環(huán)境中受到保護,在450-600 nm范圍內(nèi)發(fā)出綠色光,并具有高的熒光量子產(chǎn)率。相比之下,在500和600 nm之間,SP的閉環(huán)形式的吸收可忽略不計,而光致變色染料的開環(huán)形式在此波長范圍內(nèi)吸收,為高效FRET提供了理想方案(圖2a)。時變密度泛函理論(TD-DFT)計算表明,僅當(dāng)SP作為開環(huán)異構(gòu)體存在時才發(fā)生FRET(圖2b)。

當(dāng)在大約25nm激發(fā)時,DTM的熒光發(fā)射在納米凝膠環(huán)境中保持綠色發(fā)射(450-600 nm)。相反,在輻照同時包含DTM和SP的納米凝膠(N2-4)時,DTM通道中的綠色發(fā)射逐漸減少,并在610 nm附近出現(xiàn)了一個新峰,表明FRET供體/DTM和開環(huán)的SP之間形成了一對受體(圖2c)。如預(yù)期的那樣,可以通過用可見光照射完全恢復(fù)DTM發(fā)射,在此期間,通過將SP切換回閉環(huán)形式來阻止FRET過程。

3. 光刺激的可逆熒光壽命

《Nature》子刊: 光開關(guān)納米凝膠, 在微尺度上選擇性地存儲和顯示信息
圖3 光開關(guān)納米凝膠中熒光壽命的量化和可視化

 

時間相關(guān)單光子計數(shù)(TCSPC)的熒光壽命成像顯微鏡被用作解碼技術(shù),用于可視化局部熒光壽命。首先通過監(jiān)測不同發(fā)射波長下的壽命衰減來比較二維時間分辨的熒光衰減光譜??梢杂^察到了DTM通道中N4溶液的熒光壽命降低,由于受光刺激的FRET,開環(huán)SP的新的熒光衰減出現(xiàn)在600至650 nm之間。如圖3a,b所示,UV照射后,N1-4中的平均壽命可以從15 ns調(diào)整到28 ns,而且與兩種單體的比例線性相關(guān)。此外,通過調(diào)整到達穩(wěn)定階段之前的紫外線照射時間,可以在同一納米凝膠中獲得多個壽命(圖3c,)。N4的整個壽命衰減在UV和可見光的4個循環(huán)中是完全可逆的,沒有任何可測量的變化(圖3d)。通過熒光壽命成像顯微鏡(FLIM)進一步可視化了這種可逆行為,其中可以觀察到不同的壽命。

4. 活細胞中可逆的熒光壽命條形碼

《Nature》子刊: 光開關(guān)納米凝膠, 在微尺度上選擇性地存儲和顯示信息
圖4 功能化的光開關(guān)納米凝膠,用于在活細胞中進行終身成像

 

最后,研究者試圖研究在細胞結(jié)構(gòu)中的細胞內(nèi)編碼和解碼過程。為了靶向線粒體,在通過疊氮化物反應(yīng)基團官能化納米凝膠后,通過疊氮炔環(huán)加成將TPP與納米凝膠偶聯(lián)(圖4a)。通過共聚焦熒光分析,在TPP-N6的DTM通道和商用Mito Tracker的紅色通道之間觀察到共定位,TPP-N6的皮爾遜相關(guān)系數(shù)(PCC)為0.85,而沒有TPP修飾(0.57)的納米凝膠,表明這些材料在線粒體內(nèi)的成功定位(圖4b)。而且,跟蹤劑基團的并入不會影響納米凝膠系統(tǒng)的可逆性。與具有自發(fā)熒光效應(yīng)的傳統(tǒng)壽命條形碼材料相比,這種納米凝膠系統(tǒng)中熒光壽命的可逆性提供了一種策略,可通過減少信號強度來放大信噪比。

總結(jié)

在本文中,研究者開發(fā)了一種通過光致異構(gòu)化誘導(dǎo)的FRET過程來遠程控制聚合物納米凝膠中熒光壽命。這些納米凝膠系統(tǒng)進一步用于使用FLIM進行熒光壽命條形碼掃描,從而達到可控、可逆和非侵入性方法跟蹤并選擇性地可視化熒光多態(tài)的目的。通過同時提取壽命作為讀數(shù),納米凝膠系統(tǒng)能夠選擇性地以定量結(jié)果進行解碼,從而允許以微尺度存儲信息。作為概念驗證,通過點擊反應(yīng)將線粒體追蹤劑引入納米凝膠,從而獲得亞細胞規(guī)模的活細胞壽命條形碼,提高了成像的靈敏度。

文章鏈接:

https://doi.org/10.1038/s41467-020-16297-3

相關(guān)新聞

微信
微信
電話 QQ
返回頂部